Western Blot

WB 实验跑了半个月，还是一片白板。

6 月份了，马上就到年中总结...

不要着急。根据多年经验，

WB 没条带很可能是这些地方出了问题，今天，咱按照 WB 操作步骤好好捋一捋！

Step 1 实验前信息采集
知己知彼，百战百胜。想要获得目的蛋白，首先得了解它到底是如何表达的：组成型表达？还是诱导型表达？时空表达谱有什么特点？
 

案例分析 1
事件：2019 年 7 月，客户反馈 Proteintech 品牌 SURVIVIN 抗体（货号：10508-1-AP）做 WB 实验检测小鼠肝脏没有条带。
结果：经多篇 SCI 文献确认，同时 Proteintech 质检人员复检确认，SURVIVIN 蛋白在正常成年小鼠肝脏中基本不表达。
 

案例分析 2
事件：2018 年 5 月，客户反馈 Proteintech 品牌 IDO1 抗体（货号：13268-1-AP）做 WB 实验检测 Hela 细胞没有条带。
结果：经查阅文献资料，同时 Proteintech 质检人员复检确认，HeLa 细胞中 IDO1 蛋白需要在 IFN-γ的刺激下，才会有较高水平表达。
 

知识点： 实验前，可通过调查相关文献以及网站，查看靶标蛋白的时空表达情况，确保实验方案正确。常用的蛋白数据库有：
UniProt（https://www.uniprot.org/），一个十分强大的蛋白数据库，可了解靶标蛋白基因信息、别称、功能、可变剪切、定位及可修饰类型等；
HPA（http://www.proteinatlas.org/），The Human Protein Atlas，简称 HPA 数据库，主要通过免疫组化技术确定人体组织和细胞中的蛋白表达水平和分布；    
BioGPS（http://biogps.org/），一个基因 & 蛋白信息数据库，可通过基因的 mRNA 表达水平参考不同样本中靶标蛋白的表达水平。
Expasy（https://www.expasy.org/）一个蛋白质在线分析平台，可根据蛋白序列信息预测其分子量、等电点、亲 / 疏水性等相关信息。
另外，Paxdb 数据库，NCBI 综合数据库、UniHI 蛋白互作数据库等同样也可在线分析靶标蛋白相关信息。

Step 2 样本采集和制备
确定了合适的细胞 / 组织材料，提取高质量的蛋白样本又是一道难题。

案例分析 
事件：2019 年 5 月，客户反馈 Proteintech 品牌 FOXO3A 抗体（货号：10849-1-AP）做 WB 实验检测小鼠肝脏没有条带。
结果：客户寄回待测样本，经 Proteintech 质检人员通过考马斯亮蓝复检确认，客户样本中总蛋白含量很低，最终导致靶标蛋白信号无法被检查。
 

知识点： 制样时，首先要采集足量的样本进行裂解；其次要保持低温操作，并且裂解液中可加入一定浓度的蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，防止靶标蛋白被降解；另外不同蛋白提取方法不同，不同强度裂解液裂解程度有差异，蛋白得率有差别，对于膜蛋白和核蛋白提取，建议进一步超声处理样本，让样本裂解更充分；最后样本制备完成后要尽快进行试验，保证样本质量。

Step 3 电泳转膜
电泳阶段，上样操作是区分新手和老手的关键点，偶尔的小失误会导致条带畸形或者串样，但不会导致白板；转膜阶段，合适的膜孔径和正确的电极方向是成功关键。

案例分析 
事件：2016 年 11 月，小编亲身经历，转膜时 「三明治」方向放反，导致蛋白全跑到电泳缓冲液中，膜上一片空白（类似下图）。
 

知识点： 电泳阶段，电泳缓冲液需要现配现用，另外上样量要充足；转膜阶段，首先要根据靶标蛋白分子量大小选择合适孔径的膜（＞20kD, 选择 0.45um 孔径；≤20kD, 选择 0.22um 孔径），并且大分子蛋白迁移速度相对较慢，可适当延长转膜时间，小分子蛋白迁移速度相对较快，要防止转膜过度；其次注意电极方向，正确顺序为：负极-海绵层-胶-膜-海绵层-正极；另外，可通过丽春红染膜（可逆）和考马斯亮蓝染膜（不可逆）来判断转膜是否成功。

Step 4 一抗孵育
转膜封闭完成后，选择合适的一抗使用合理的稀释度进行孵育，是 WB 实验成功的关键。

案例分析 
事件：以 TDP43 蛋白为例，当在 Proteintech 官网上搜索 「TDP43」时，会出现以下四个相关产品，我们需要根据抗体名称、抗体类型、适用种属以及适用实验等信息筛选出最正确的产品。
 

知识点： 一抗选择时，(a) 要确认靶标全称（full name）, 很多蛋白缩写相同，且有异构体或者被修饰，要确认抗体名称和靶标名称对应；(b) 认准抗体类型，根据需要挑选抗体种属来源，兔多抗、鼠单抗 ,,,,,(c) 确认适用种属，由于蛋白序列保守性和差异性，有些抗体能识别多种物种，有些则不能；(d) 确认应用范围，适合 WB 实验的不一定适合 FC，根据产品公示应用范围确认抗体能否进行自己需要的实验 。一抗使用时，a) 根据抗体说明书推荐的稀释度和孵育条件（包括温度、时间）合理孵育；b) 按照说明书推荐温度、推荐方式储存抗体，防止抗体失效。（当然：挑选抗体的最好方法还是打电话给抗体客服，让他给你直接推荐。）

Step 5 二抗孵育
合适的一抗需要搭配合适的二抗。

案例分析 
事件：2019 年 7 月，客户反馈 Proteintech 品牌 GAPDH 内参抗体（货号：60004-1-Ig）做 WB 实验没有条带。
结果：经 Proteintech 技术支持确认产品反馈表发现：GAPDH 抗体（货号：60004-1-Ig）为鼠单抗，而客户采用的二抗为 「羊抗兔」。
 

知识点： 二抗选择遵循一个标准：一抗是什么种属来源，二抗就抗什么种属。一抗是兔多抗，二抗选择抗兔；一抗是鼠单抗，二抗选择抗鼠 ...... 二抗使用时同样需要根据抗体说明书推荐的稀释度和孵育条件（包括温度、时间）合理孵育，按照推荐条件和温度储存。

Step 6 显影
抗体孵育完成后，进行显影。根据实验需求选择合适显影手段，以最常用的 ECL 化学发光检测试剂盒为例。

案例分析 
事件：2019 年 3 月，Proteintech 研发人员使用 RUVBL1 抗体（货号：10210-2-AP）做 WB 实验检测 HEK293 细胞，通过梯度抗体浓度和曝光时间检测不同等级 ECL 试剂盒的差别，其中普通级 ECL、短时间曝光的条带非常微弱，近乎白板。
 

知识点： 显影时，根据蛋白丰度选择合适的 ECL 检测试剂盒，低丰度蛋白选择超敏级 ECL 试剂盒 + 长曝光，防止信号丢失出现白板；高丰度蛋白选择普通级 ECL 试剂盒 + 短曝光，防止过曝出现杂带；另外，叠氮钠对 HRP 有抑制作用，会影响显色效果；显影液过期或者配置错误也可能导致 WB 实验结果无条带。

总之呢，Western Blot 虽然是免疫学实验中最基础的、入门级的实验操作，但想要得到一个完美的实验结果真的非常非常不容易，每一步的操作都必须谨小慎微，每一刻时间都需要严格把控，这是科研的门槛所在，也是科研魅力之所在！
在此，希望每一个被 WB 折磨过的萌新，最终都能学有所成，成就科研大神！