几天前，有粉丝后台留言，想要一份 WB 常用试剂配方，说他们实验室之前以干实验为主，WB 这方面没啥经验。

哟呵，这不正是小 P 擅长的领域嘛 ～

于是小 P 刷刷从咱官网复制了一份最.新版「WB 常用试剂配方」给他。

对，就是 Proteintech 官网（ptgcn.com）。是不是都不知道我们官网还有这版块？

 

考虑到很多人对咱们官网的不熟悉，这里小 P 直接将咱们研发部门亲测、并优化过的 WB 常用试剂配方按照实验操作顺序整理成图文形式，有需要的记得收藏哈 ～
 

1.WB 样本制备相关试剂

做 WB 实验，我们第一步就是要获得待测蛋白样本，这里我们一般会用到样本裂解液（Lysis Buffer）。

一般裂解液包含以下几个组份：缓冲系统、盐离子、离液剂、还原剂和蛋白酶抑制剂。其中蛋白酶抑制剂种类繁多，可根据实验需求挑选合适品类。

▲ 蛋白酶抑制剂类型

RIPA 裂解液（RIPA buffer）是一种传统的细胞组织快速裂解液，通常用来作为 WB 提取蛋白首.选裂解液。Proteintech 有一万多种抗体都经过 wb 检测，其中绝大部分靶标蛋白都使用 RIPA 裂解液提取。

并且生产测试过程中，我们研发人员也对传统的 RIPA 裂解液做了一些改进，以下是改进版 RIPA 裂解液配方：

 

除了可以根据目标蛋白的表达部位选择不同的裂解液以获得较好的提取效果以外（如膜蛋白或组蛋白），任何组分提取均可采用小 P 推荐的这款 RIPA 裂解液哦 ～

 

2. 凝胶制备相关试剂

聚丙烯.酰胺凝胶电泳简称为 PAGE，它有两种形式：SDS-PAGE 及 Native-PAGE。

SDS-PAGE 体系中有 SDS，适用于变性蛋白，是最常用的一种 PAGE, 靶标电泳移率仅与分子量相关；Native-PAGE 为非变性体系，主要用来分析活性蛋白及复合物，靶标电泳迁移率与分子量及电荷大小均相关。

▲ SDS-PAGE 电泳示意图

在 SDS-PAGE 中，凝胶对蛋白质的分离取决于凝胶所形成的孔径大小，而凝胶孔径大小与凝胶浓度相关（指分离胶浓度，即每 100 亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度），故不同分子量的蛋白质选择不同的凝胶浓度，分离效果会更好。

▲ 不同分离胶的线性分离范围

对于常规大于 10kDa 的蛋白，一般采用以下不同浓度的 SDS-PAGE 分离胶配方：

  

10% 过硫.酸铵母液（质量体积比 10%）配好后需 4℃ 冷藏，且建议在 1 周内使用。40% 丙烯.酰胺母液和 2x 分离胶缓冲液配方如下：

 

浓缩胶一般采用 4% 浓度的胶，以下为不同体积的 SDS-PAGE 浓缩胶配方：

 

对于分子量小于 10KDa 的蛋白，建议使用 Tris-Tricine 胶 (三层胶) 体系。其中间隙胶可以阻挡一些大分子量的蛋白，从而使小分量的蛋白或肽段能够在分离胶内得到更好的呈现。

 ▲ Tris-Tricine 三层胶示意图

Tris-Tricine-SDS-PAGE 配方如下：

 

3. 上样及电泳相关试剂
进行电泳之前的蛋白样本，我们还需要将其与上样缓冲液（loading buffer）混合，该缓冲液中含 SDS，使得蛋白变性并带有相同电荷；含甘油，增加样本密度便于样本沉淀在加样孔底部；含溴酚蓝，指示跑胶时样本的大概位置；含 DTT，还原打断蛋白中的二硫键。

4X SDS 上样缓冲液配方如下：

 

蛋白与上样缓冲液充分混匀后，95℃ 煮沸 5 分钟，室温冷却后即可进行上样。随后开始电泳。

电泳前我们需要准备好电泳缓冲液。常规 SDS-PAGE 采用的是 Tris-Gly 系统电泳缓冲液，配方如下：

 

对于 Tris-Tricine-SDS-PAGE 采用的是 Tris-Tricine 系统电泳缓冲液，该缓冲液分为 Tris-Tricine 阴极电泳缓冲液和 Tris-Tricine 阳极电泳缓冲液，具体配方如下：

 

4. 转膜及孵育相关试剂

电泳完成后，需要将胶上的蛋白转移到膜上面。需要用到转膜缓冲液。根据转膜方式不同，转膜缓冲液配方也有一定变化，以下是两种常用转膜缓冲液配方：

 

转膜完成之后，我们即可进行封闭和抗体孵育过程，这个过程中用量比较大的试剂是 1X TBST 洗涤液，其配方如下：

 

转膜结束后，即可进行显色操作。目前一般采用增强化学发光（ECL），酶促底物 DAB 显色和荧光二抗显影三种方法进行显色，这些步骤都需要配套的商业化产品进行操作，小 P 这里就不展开了。

好啦，以上就是小 P 今天要分享的全部内容，相信对部分 WB 新手玩家还是比较有帮助的，有需要的记得收藏哈 ～ 如有不确定的地方，请直接留言小 P 交流哦 ～

当然，有些人肯定觉得试剂配起来特别麻烦，一不小心还容易出错，要是有商业化的产品直接使用就好了。

其实，不瞒你们说，Proteintech 已经上线了部分 WB 常用小试剂产品啦，以下是产品列表，推荐给大家。有需要的可以直接订购哈，物美价廉，超级实用！

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