线粒体研究神器！5种氧化磷酸化复合物检测“一网打尽”~

线粒体在细胞产能、代谢和细胞信号传导中发挥重要作用。线粒体代谢的核心就是氧化磷酸化（OXPHOS），细胞使用酶来氧化营养物质，从而将化学能转化为生物能量货币—ATP。大部分细胞 ATP 是通过三羧酸（TCA）循环逐步氧化底物在线粒体中产生的。除了提供大部分能量外，线粒体还会产生活性氧（ROS）。

 

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氧化磷酸化过程

细胞通过两种主要途径获取ATP，糖酵解和氧化磷酸化。糖酵解发生在细胞质，氧化磷酸化在线粒体中进行。糖酵解可快速供能，但氧化磷酸化能为细胞提供更多的能量并且以产生ROS为代价。氧化磷酸化过程中每消耗一个葡萄糖分子产生约32个ATP分子，而糖酵解仅产生2个ATP分子。

两种过程的重要性程度因细胞类型而异。例如心脏组织富含线粒体，通过氧化磷酸化供能，但来自胸腺的增殖细胞具有高度糖酵解的能力。在大脑中，超过90%的ATP是通过氧化磷酸化途径产生的。与星形胶质细胞相比，神经元具有更多的活性丙酮酸脱氢酶和更高的三羧酸循环（TCA）活性，这一特性更有利于氧化磷酸化发生而不是糖酵解。而星形胶质细胞的能量需求主要通过糖酵解来满足，因其含有较少的线粒体[1]。

图1：人类细胞中产生ATP的主要途径（图源参考文献2）

氧化磷酸化需要线粒体内膜转运链中的蛋白质通过一系列氧化/还原反应来传输电子。参与氧化磷酸化的蛋白主要包括Complex I-V，辅酶Q（CoQ）及细胞色素C（Cytochrome c）。

在此过程中，来自糖酵解和脂肪酸代谢的乙酰CoA进入三羧酸循环（TCA），三羧酸循环产生的NADH、FADH₂等提供氧化磷酸化的初始原料。电子传递沿着Complex I、Complex II→CoQ→Complex III→Cytochrome c→Complex IV进行。通过氧化还原反应将O₂还原成H₂O。其中伴随有ROS产生。低水平的ROS可维持细胞稳态，过量的ROS可能会损害脂质膜、蛋白质和核酸，并在线粒体相关疾病的发病机制中发挥作用。质子被泵入线粒体内膜空间，质子的易位在线粒体内膜上产生电位差。在O₂的存在下，电子传递链（ETC）通过化学渗透偶联机制驱动ADP通过ATP合酶（Complex V）合成 ATP。

图2：氧化磷酸化过程（图源Proteintech）

 

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氧化磷酸化系统

参与氧化磷酸化的蛋白质有90多种，由核DNA及线粒体DNA（mtDNA）编码。核DNA编码70多个蛋白质。线粒体DNA编码13个结构蛋白亚基，以及线粒体内蛋白质合成所需的2个核糖体RNA（rRNA）和22个转运RNA（tRNA）。

五个氧化磷酸化复合物中有四个包含由两个不同的基因组编码的亚基，这使氧化磷酸化过程变得更加复杂。Complex II 完全来自于核编码DNA，Complex I中有7个蛋白（MTND1，MTND2，MTND3，MTND4，MTND4L，MTND5，MTND6）、Complex III中MTCYB、Complex IV的3个蛋白（MTCO1，MTCO2，MTCO3）及Complex V中的2个蛋白（ATP6，ATP8）来自线粒体DNA。

图3：OXPHOS系统的生物发生（图源参考文献3）

Complex I是氧化磷酸化系统中最大的复合物，由45个亚基参与。其中14个亚基组成了Complex I的核心区域，其余亚基对复合物的稳定性和组装起重要作用，并以L型横跨线粒体内膜延伸到线粒体基质中。

Complex II由核DNA编码的4个蛋白（SDHA，SDHB，SDHC和SDHD）组成。SDHC和SDHD嵌入在内膜中，起稳定结构作用。SDHA和SDHB突出在基质中，来源于琥珀酸氧化的两个电子从SDHA和SDHB转移到辅酶Q。

Complex III由11个亚基构成，其中一个来源于线粒体DNA。MTCYB、CYC1和UQCRFS1构成Complex III的核心区域，并与其余7个起组装和稳定作用的亚基一起构成紧密结合的对称结构。

Complex IV由14个亚基组成。其将电子传递给氧，氧离子接受电子和氢离子形成水，约95%的氧气在此消耗。

Complex I、Complex III、Complex IV产生的H⁺回流与ADP和Pi形成ATP，通过由19个亚基组成的Complex V介导。

 

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氧化磷酸化与疾病研究

缺氧是实体肿瘤的一个特征，并且与正常细胞相比，在癌细胞中氧糖酵解水平上升。这一现象的经典理论就是瓦博格效应（Warburg effect）。因此，之前普遍认为在癌细胞中，氧化磷酸化活性降低。但越来越多的研究表明，在某些癌细胞中氧化磷酸化仍然非常活跃，包括白血病、淋巴瘤、胰腺导管腺癌、高氧化磷酸化亚型黑色素瘤和子宫内膜癌等。这和肿瘤可能具有代谢异质性有关，如与大部分胰腺肿瘤细胞（可能是非干细胞）相比，具有高转移和致瘤潜能的肿瘤干细胞更依赖于氧化磷酸化。

由此，氧化磷酸化抑制剂被提出，并被认为是治疗癌症的潜在药物。例如二甲双胍（Metformin）是用于治疗II型糖尿病的药物。随后的体内研究也表明，二甲双胍可以在多种不同的模型中抑制肿瘤生长或提高辐射敏感性，其关键机制或许是抑制了氧化磷酸化系统中的Complex I。下表展示了目前部分用于氧化磷酸化的抑制剂药物。

表1：作为抗癌药物的OXPHOS抑制剂（图源参考文献4）

参与氧化磷酸化过程的基因的突变或缺失也会导致的线粒体缺陷疾病。由于线粒体是细胞所必须的，各个组织可能都会受到线粒体缺陷的影响，临床上最常见的缺陷疾病是在肌肉、心脏及大脑这些具有高代谢需求的组织中。大约三分之一的线粒体缺陷疾病都是关于Complex I的缺陷，甚至由于Complex I组成蛋白的繁多和复杂性，很多由它导致的缺陷性疾病都难以被检测出来。Complex IV和Complex I的缺陷疾病一样常见。Complex II的缺陷导致的疾病相比而言更少（<10%），主要的临床疾病为线粒体脑肌病和家族性副神经节瘤。Complex III的缺陷疾病也相对罕见，更多的可能是线粒体DNA编码的MTCYB的突变。下表是氧化磷酸化中可能导致的一些线粒体疾病。

表2：OXPHOS相关的线粒体疾病（参考文献5）

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小结

看完上面内容，相信大家对氧化磷酸化OXPHOS有了更深入的了解。小P也总结了一些要点。

OXPHOS作为线粒体代谢的核心，发挥将营养物质转化为能量（ATP）的作用。参与这一过程的主要为复合物Complex I-V，其中Complex I-IV参与电子传递，Complex V合成ATP。

OXPHOS和电子传递链（ETC）已被认为与多种重要的生理过程相关，包括细胞死亡、活性氧ROS产生、缺氧耐受、炎症、糖脂代谢等。因此，OXPHOS系统中任何一个环节发生改变都与多种疾病相关。检测和对比Complex I-V水平变化，不仅可以了解这些复合物如何调节并发挥作用，还能通过表征OXPHOS的变化，为线粒体相关疾病研究提供支持。

 

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Various lysates were subjected to SDS PAGE followed by western blot with PK30006 (OXPHOS Cocktail (Human recommended)) at dilution of 1:4000 incubated at room temperature for 1 hours.

除了1=5的OXPHOS Cocktail，小P还整理了常用复合物蛋白抗体，希望能给大家的实验带来帮助！

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参考文献

[1] Cunnane SC, Trushina E, Morland C, et al. Brain energy rescue: an emerging therapeutic concept for neurodegenerative disorders of ageing. Nat Rev Drug Discov. 2020 Sep;19(9):609-633.

[2] Jourdain AA, Begg BE, Mick E, et al. Loss of LUC7L2 and U1 snRNP subunits shifts energy metabolism from glycolysis to OXPHOS. Mol Cell. 2021 May 6;81(9):1905-1919.e12.

[3] Koopman WJ, Distelmaier F, Smeitink JA, et al. OXPHOS mutations and neurodegeneration. EMBO J. 2013 Jan 9;32(1):9-29.

[4] Boreel DF, Span PN, Heskamp S, et al. Targeting Oxidative Phosphorylation to Increase the Efficacy of Radio- and Immune-Combination Therapy. Clin Cancer Res. 2021 Jun 1;27(11):2970-2978.

[5] Ghezzi D, Zeviani M. Human diseases associated with defects in assembly of OXPHOS complexes. Essays Biochem. 2018 Jul 20;62(3):271-286.