如何拿捏花式细胞死亡？集齐这些刺激物轻松搞定！

除了磷酸化，细胞死亡也是我们研究中绕不开的重要话题。截止目前，多种细胞死亡方式被发现，凋亡、焦亡、铁死亡、铜死亡......这么多“花式死法”，我们应该如何在实验中顺利“激活”？并确保击中“李逵”而不是“李鬼”呢？选择合适的刺激物至关重要！

这次小P就来带着大家，仔细扒一扒在不同的细胞死亡过程中常用的刺激物吧！

 

细胞死亡途径包括细胞凋亡（Apoptosis）、坏死性凋亡（Necroptosis）、细胞焦亡（Pyroptosis）、铁死亡（Ferroptosis）、铜死亡（Cuproptosis）、双硫死亡（Disulfidptosis）、细胞自噬（Autophagy）等。不同的细胞死亡机制参与的蛋白不一样，下图展示了不同细胞死亡方式的简化过程，接下来我们就来逐个讨论。

▲图1：不同细胞死亡方式简略图（图源Proteintech）

 

01 细胞凋亡（Apoptosis）

细胞凋亡有两条途径：内在途径（Intrinsic pathway）和外在途径（Extrinsic pathway）。

内在途径也称为线粒体途径，受BCL-2家族调控。在这一途径中，BCL-2家族成员BAX和/或BAK的激活允许凋亡效应因子渗透线粒体外膜，导致细胞色素c进入细胞质，并在此与APAF-1结合，触发凋亡小体的形成。该凋亡小体首先激活Caspase-9，随后产生一系列蛋白水解效应激酶。线粒体外膜透化（MOMP）还有助于线粒体释放额外的凋亡因子，它们可抑制凋亡关键效应因子Caspase-3[1,2]。

外在途径也称死亡受体途径，由肿瘤坏死因子（TNF）或Fas细胞表面死亡受体家族等驱动。这些成员具有胞内死亡结构域，可诱导信号复合物的形成，导致Caspase-8和下游效应Caspase（Caspase-3和-7）的激活。此外，该途径还可以通过Caspase-8介导的促凋亡蛋白BID的蛋白水解过程激活而与内源性凋亡通路连接起来[2]。

 

▲图2：细胞凋亡机制图（图源Proteintech）

1、MG-132

凋亡诱导剂。蛋白酶体（Proteasome）抑制剂，有效阻断26S蛋白酶体复合物的蛋白水解活性。MG-132（货号：CM00367）也是自噬激活剂。

2、Staurosporine

凋亡诱导剂。Staurosporine（货号：CM00517）是一种有效，ATP 竞争性的，非选择性蛋白激酶抑制剂。Staurosporine处理细胞后Caspase 3剪切体的表达变化（见下图）。

▲图3：使用Caspase3/p17/p19兔多抗的WB检测结果（图源Proteintech）

3、Z-VAD-FMK

凋亡抑制剂。Z-VAD-FMK（货号：CM10656）是广谱的Caspase抑制剂，对Caspase家族成员有不同程度的抑制作用。

 

▲图4：Z-VAD-FMK处理后Caspase蛋白表达变化（图源参考文献3）

 

 

02 坏死性凋亡（Necroptosis）

 

坏死性凋亡的关键蛋白是RIPK1、RIPK3和MLKL。RIPK1和RIPK3受胞外因子激活，如肿瘤坏死因子TNF。MLKL作为RIPK3的底物，在Ser358位点被磷酸化。MLKL蛋白存在催化缺陷，通过其自身寡聚化并易位到细胞膜形成孔道，破坏细胞膜结构，导致坏死性凋亡。

 ▲图5：细胞坏死性凋亡机制图（图源Proteintech）

1、TNF alpha+ Z-VAD-FMK+ SM-164

坏死性凋亡诱导剂。TNF alpha（货号：HZ-1014）激活RIPK1和RIPK3，SM-164（货号：CM20410）是XIAP的拮抗剂，Z-VAD-FMK（货号：CM10656）抑制凋亡。联合处理较单独使用其中一种刺激物对诱导坏死性凋亡的效果更好（图4）。三种联合处理的试剂也可以用相似功能的试剂代替，比如TNF alpha可以换成IFN gamma（货号：HZ-1301）或TRAIL处理。

▲图6：TNF alpha+ Z-VAD-FMK+ SM-164联合或单独处理后磷酸化MLKL蛋白表达变化（图源参考文献4）

 

2、Necrosulfonamide/NSA

坏死性凋亡抑制剂。选择性靶向MLKL蛋白N端卷曲螺旋结构域，而不影响RIPK3对MLKL的磷酸化。因此使用NSA（货号：CM05180）后，在WB检测中不会明显观察到MLKL的磷酸化水平变化，但细胞死亡率降低。

▲图7：NSA处理后细胞死亡及相关蛋白表达情况（图源参考文献5）

3、Necrostatin 1/Nec 1

坏死性凋亡抑制剂。抑制RIPK1激酶活性。Necrostatin 1（货号：CM00423）也是一种吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）抑制剂。

4、GSK-872

坏死性凋亡抑制剂。GSK-872（货号：CM06404）高亲和力结合RIPK3激酶结构域抑制激酶活性。

 

03

细胞焦亡（Pyroptosis）

细胞焦亡的关键蛋白是Caspase 1和GSDMD。GSDMD鉴定为半胱天冬酶底物和焦亡的重要介质。Caspase 1裂解GSDMD的N末端片段快速靶向细胞膜，并诱导质膜孔的形成，细胞内容物释放，诱发严重的炎症反应。

▲图8：细胞焦亡机制图（图源Proteintech）

1、LPS

细胞焦亡诱导剂。LPS（货号：CM20313）参与非经典细胞焦亡途径，激活Caspase 4/5裂解GSDMD。

2、Nigericin Sodium/Nig

细胞焦亡诱导剂。Nigericin sodium salt是从吸水链霉菌中得到的一种抗生素，NLRP3炎症小体激活剂。如下图，Nigericin Sodium salt（货号：CM06098）处理细胞导致细胞焦亡，甘氨酸是一种细胞保护剂，可防止焦亡细胞裂解，但不能防止GSDMD孔的形成，也不影响IL-1α和IL-1β的成熟。

▲图9：Nig处理后焦亡相关蛋白表达变化（图源参考文献6）

3、Raptinal

细胞焦亡诱导剂。Raptinal（货号：CM08346）直接激活Caspase-3并在多个细胞系中启动内在的Caspase依赖性凋亡途径。（点击查看应用实例）

4、Disulfiram

细胞焦亡抑制剂。Disulfiram（货号：CM00111）有效抑制GSDMD孔形成从而抑制细胞焦亡。

 

04

铁死亡（Ferroptosis）

铁死亡的特征是细胞内铁和脂质过氧化的积累，导致氧化损伤并最终破坏细胞膜。主要分为GPX4调节途径、铁代谢途径和脂质代谢途径。GPX4通过限制脂质过氧化物和活性氧（ROS）来有效抑制铁死亡。

▲图10：铁死亡机制图（图源Proteintech）

 

1、Erastin

铁死亡诱导剂。Erastin（货号：CM01165）结合且抑制电压依赖性阴离子通道 （VDAC2/VDAC3）；能够通过直接抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白系统Xc-活性来降低谷胱甘肽（GSH）水平。

2、RSL3

铁死亡诱导剂。RSL3（货号：CM01193）是GPX4的抑制剂，可直接作用于GPX4使其失活，从而诱导脂质过氧化产生ROS。

▲图11：RSL3处理后铁死亡相关蛋白的表达变化（图源参考文献7）

3、Ferrostatin-1

铁死亡抑制剂。抑制Erastin诱导的HT-1080细胞铁死亡。Ferrostatin-1（货号：CM00719）是一种人工合成的抗氧化剂，通过减轻铁死亡来减少细胞死亡。

 

05

铜死亡（Cuproptosis）

铜死亡依赖于细胞内铜离子的积累，铜离子直接结合三羧酸循环（TCA）中的脂酰化成分，导致这些蛋白聚集、失调，阻断了三羧酸循环（TCA），Fe-S簇蛋白的丢失，从而引起蛋白毒性应激反应并导致细胞死亡。FDX1是铜死亡的关键调控因子，也是蛋白质脂酰化的上游调节因子。

▲图12：铜死亡机制图（图源Proteintech）

 

1、Elesclomol/ES

铜死亡诱导剂。Elesclomol/ES（货号：CM00610）是一种有效的铜离子载体。FDX1作为Elesclomol的直接结合剂发挥作用。

2、Glutathione/GSH

铜死亡抑制剂。GSH（货号: CM00285）作为一种含硫醇的铜螯合剂，可阻止铜死亡。

 

 

06

双硫死亡（Disulfidptosis）

双硫死亡是NADPH供应不能满足细胞将胱氨酸还原成为半胱氨酸。高表达SLC7A11的细胞在葡萄糖饥饿条件下，胞内的胱氨酸等二硫化物会发生异常积累，诱发二硫化物应激，使肌动蛋白细胞骨架中二硫键含量升高，造成肌动蛋白丝收缩，破坏细胞骨架结构，造成细胞死亡。

▲图13：双硫死亡机制图（图源Proteintech）

 

1、BAY-876

双硫死亡诱导剂。BAY-876（货号：CM04263）是一种GLUT抑制剂，选择性的抑制葡萄糖转运蛋白 1 （GLUT1），对GLUT1的抑制效果是 GLUT2，GLUT3 和 GLUT4 的 130 倍以上。通过抑制葡萄糖摄入，从而诱导双硫死亡。

2、DTT

双硫死亡抑制剂。DTT（货号：CM00228）是一种还原剂，还原二硫键，降低二硫化物的积累，抑制双硫死亡。

 

07

自噬（Autophagy）

广义的细胞自噬是细胞内容物或受损的细胞器等包裹形成自噬体，自噬体与溶酶体融合，将其中的物质降解产生能量和小分子的过程。

1、Rapamycin

自噬诱导剂。Rapamycin（货号：CM01006）通过抑制mTOR的活性达到诱导自噬的作用。

2、Chloroquine

自噬抑制剂。Chloroquine（货号：CM02020）处理会增加自噬体结合的LC3-II和p62，抑制自噬体降解。自噬体积累会阻止受损细胞内细胞器和蛋白质的清除，最终导致细胞死亡。Chloroquine也是Toll样受体（TLRs）的抑制剂。经过Chloroquine处理的细胞可明显看到p62的聚集。

▲图14：Chloroquine处理后p62聚集（图源Proteintech）

Immunofluorescent analysis of (-20°C Ethanol) fixed Chloroquine treated HepG2 cells using P62,SQSTM1 antibody (18420-1-AP) at dilution of 1:1500 and CoraLite®488-Conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), CL594-Phalloidin (red).

3、Bafilomycin A1/BafA1

自噬抑制剂。它是特异性、可逆的V-ATPase抑制剂。Bafilomycin A1（货号：CM18694）阻断自噬体与溶酶体的融合。

 

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