WB样本堵孔解决方案

WB蛋白样品堵孔的原因主要来源于以下四类情况：

一、脂类对浓缩胶点样孔的堵塞

解析：

此类主要堵塞集中在浓缩胶部分，SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色结果显示浓缩胶部分孔口着色深且有弥散状或出现浓缩胶被堵塞后明显比分离胶部分宽，分离胶条带少等。

对策：

对于此类样品我们可以将样品静置在冰上或4℃冰箱，让脂类析出，从而去除脂类。

二、样品粘度高而引起的堵孔

解析：

此类堵孔是由于样品中的核酸片段未被打断，样品粘度高而引起的，主要表现为上端条带模糊且条带的上部分比下部分宽。

对策：

对于此类样品我们可以将样品重新进行超声破碎，彻底的将样品中的核酸打断成小片段，从而降低样品的粘度。

三、裂解不充分而引起的堵孔

解析：

此类堵孔是由于裂解液加入量过少，导致蛋白浓度过高而聚集形成复合体，当加入变性剂和高温煮样后，此类蛋白复合物完全变性，从而堵在浓缩胶和分离胶点样孔口。

对策：

由于此类蛋白复合物已经完全变性，此时再去尝试打开此类复合物，会非常的困难。对于此类样品小P也尝试过各种拯救的方法，效果都不太理想。最佳的方法还是在样品变性之前，加入足量的裂解液，将样品浓度降下来，才能够打开此类复合体。

四、还原剂的失效而形成的蛋白复合物

解析：

此类堵孔是由于存放过程中，样品中的还原剂被氧化或挥发而导致蛋白之间再次聚集而形成的复合物。（还原剂失效而形成复合物堵塞可见Proteintech公众号此篇：《WB蛋白样品完全变性后是否就足够稳定了？我们做了一组实验...》

对策：

此类由还原剂失效而导致蛋白聚合形成的复合物不同于第三类裂解不充分形成的复合物，这类复合物是可逆的，保存一段时间后的样品再次使用前只需补加适量的还原剂重新煮样就可以打开此类复合物了。

注意：新制备的样品如果裂解不充分带来的堵孔，补加还原剂效果也会不尽人意。如下图浓缩胶点样孔部分基本没有多大改善，改善明显的还是第四类还原剂失效形成的复合物（见下图分离胶孔部分）。

 

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